Peter Parker (Andrew Garfield) é um rapaz tímido e estudioso, que iniciou há pouco tempo um namoro com a bela Gwen Stacy (Emma Stone), sua colega de colégio. Ele vive com os tios, May (Sally Field) e Ben (Martin Sheen), desde que foi deixado pelos pais, Richard (Campbell Scott) e Mary (Embeth Davidtz). Certo dia, o jovem encontra uma misteriosa maleta que pertenceu a seu pai. O artefato faz com que visite o laboratório do dr. Curt Connors (Rhys Ifans) na Oscorp. Parker está em busca de respostas sobre o que aconteceu com os pais, só que acaba entrando em rota de colisão com o perigoso alter-ego de Connors, o vilão Lagarto.